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毛細管電色譜.ppt

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Capillary Electrochromatography 毛細管電色譜 (CEC) CEC發展進程1952年Mould 和Synge首次在色譜分析上使用了電滲流,他們在薄層色譜上利用電場分離了膠棉中的多糖化合物。1974年Pretorius才首次成功地實現了在填充毛細管液相色譜中用電滲流取代泵,并獲得了比傳統液相色譜高的柱效能,但是由于Pretorius當時所用的柱子管徑較大 ,因此CEC的優越性沒有得到充分展示,所以在70年代后期 ,此法沒有得到充分重視。直到1980年Otsuka才又發表了一篇有關CEC的文章。1981年Jorgenson等用CEC分離了兩種毛細管區帶電泳難以分離的電中性芳香化合物后,逐漸引起人們的重視,關于CEC的文章陸續得到了報道。1987年特別是在Knox從理論上闡述了CEC高效性的特點以后,毛細管電色譜才真正的得到了飛速發展并成為一個新的研究方向。 毛細管電色譜(CEC)是在毛細管中填充或在毛細管壁涂布、鍵合色譜固定相,依靠電滲流(或電滲流與壓力流結合)推動流動相,使溶質分子依據它們在固定相和流動相中的分配平衡常數不同和電泳速度不同而達到分離目的的一種電分離模式. 也定義為:一種溶質與固定相間的相互作用占主導地位的電泳過程。CEC基本原理1、微型分離技術2、micro-HPLC 和 CE的結合3、電滲流 (EOF) 為流動向的推動力4、二維分離機理:液相色譜和電泳之和(分配和電泳淌度)CEC與HPLC原理的比較:CEC:是采用具有塞狀流型的電滲流推動流動相,其線速度是與柱的直徑和填料顆粒大小無關的。因而在毛細管中幾乎沒有流速梯度,譜帶展寬效應很小。HPLC:是采用壓力驅動流動相,流速隨填料顆粒大小和柱長而變化,流速在管中呈拋物線狀輪廓,因而造成譜帶展寬和柱效的降低。HPLC 和 CEC 的柱效比較粒徑(?m)HPLCCEC柱長(cm) 塔板數柱長(cm)塔板數55045,0005090,00033050,00050150,0001.51533,00050210,000CEC的操作模式用電滲流驅動的電色譜 由于儀器結構簡單,應用面比較廣。用電滲流和泵雙重驅動的電色譜 優點:避免在分離過程中氣泡的產生,同時可以用泵來控制 流速,縮短分離時間。電滲流的特性CEC結合了色譜和電泳的優點: ?分離范圍廣(可分離中性及離子化的化合 物); ?分辨率高:由于柱內無壓降,可以使用小粒度固定相及長柱子; ?柱效高; ?具有HPLC的多種選擇性。CEC 的缺點1、在傳統的CEC模式中,由于焦耳熱效應,常常會遇到氣泡和“柱內干涸”等問題; 2、氣泡的出現會導致基線不穩、重現性不好、電滲流的中斷等現象;3、在傳統的CEC系統中加入一個u-HPLC泵,依靠電滲流結合壓力流的模式來驅動流動相的一種新技術,就是熟悉的加壓毛細管電色譜(pressurized capillary electrochromatography ,簡稱pCEC) pCEC (1)改變泵壓可有效地調節樣品中各組分的保留,提高分離度; (2)有效地縮短樣品的分析時間; (3)減少流動相和毛細管中 (4)易于實現梯度洗脫;pCEC研究的熱點:CEC理論的研究;儀器聯用技術的發展;梯度洗脫技術; 毛細管柱的制備(填充柱或整體柱);芯片技術;應用領域拓展(環境分析,食品分析,生化分析等); CEC研究熱點和難點熱點:電色譜理論的研究和完善柱制備技術的研發 填充式、 開管式和整體柱式應用領域的拓寬 環境領域、 醫藥和生化領域手性拆分難點:柱制備技術焦耳熱效應塞子效應氣泡問題Basic instrumentation of CEC儀器 主要包括四個模塊:流體輸送單元(Solvent Delivery Module);微流控制單元(Micro Flow Control Module);高壓電源(High Voltage Module);檢測器(Detection Module)和數據采集軟件。各部分分別開關、設置工作參數和程序。 使用溫度10-35℃,相對濕度不大于75%??梢赃M行毛細管微柱色譜、毛細管電色譜、加壓毛細管電色譜、毛細管電泳分析。 TriSepTM-2100加壓毛細管電色譜儀操作流程 準備工作:樣品:過濾(0.45或0.22μm濾膜)流動相:過濾(0.45或0.22μm濾膜),脫氣, (注意:超聲脫氣時,水太熱了要換)各單元參數設置及操作 1.溶劑輸送單元1.1 參數設置:反復按 FUNC/BACK 鍵至顯示所要設置的參數,按數字鍵輸入后,ENTER 確認;設置下一參數,主要參數設置完成,按CE 回到初始畫面。常用參數包括流速FLOW(正常流速為0.02-0.05mL/min, 如果在這個流速范圍內進樣量太大,就增加流速;反之就減小流速)、最高、最低限壓P.MAX/P.MIN等(最低限壓建議設置大于0的數值,否則漏夜、進氣保護功能不能發揮作用)1.2.3 編輯梯度送液程序:在主泵上設置流速FLOW、基本輸液比例CONC,編輯時間程序: EDIT 進入編輯狀態,輸入時間數值,滾動FUNC/BACK 到BCNC輸入B相的梯度比例數值,按ENTER確認。常用的參數如BCNC(A、B液比例)、FLOW(流速)、STOP(停止程序)…等。程序編好后,反復按ENTER查看,按DEL清除錯誤的程序步。按主泵RUN鍵運行時間程序, 關掉RUN鍵,泵按梯度初始化條件走。 確認各溶劑系統互溶、緩沖溶液中溶質不會析出結晶! 1.3 系統排氣或快速更換溶劑系統 把泵的吸濾頭放進已經過濾并除氣后的流動相中,加電時出口緩沖瓶中也裝滿相同的緩沖溶液。將Drain閥向OPEN方向(逆時針)旋轉180度,按Purge鍵,約3分鐘后自動停止, 也可自己調整Purge 時間,直到管線內(由溶劑瓶到泵入口)無氣泡為止。Close Drain閥。把流速調成1ml/min,把四通處連接反壓閥的peek螺絲松開,十分鐘后再把流速調成0.05ml/min, 把反壓閥的peek螺絲擰緊。 2.紫外-可見檢測器 開啟電源后,經過短暫的時間,氘燈點亮,波長顯示為254 nm。(不一定是254nm,而是上次關機時使用的波長),按FUNC/BACK鍵到改波長處,輸入實驗需要的波長值, ENTER確認,檢測器一般30-60min的預熱,然后按ZERO基線調零后,基線穩定后,可以進樣。 注意:開色譜軟件前要把微流控單元的開關打開。否則軟件打不開。3.高壓電源 輸出電壓:0-30kV;電流:0-100μA;最大功率:1W 注意:當設置10kV以上電壓時,應設置較長升壓時間(如10秒),突然升壓可導致破壞性后果;當環境潮濕時,不要設置超過10kV的電壓。 3.1 開機后,按MENU ,以上下箭頭選擇分析模式:電色譜或電泳,ENTER確認 3.2 以上下左右箭頭輸入電壓(最小單位100V)、升壓時間和電場方向/,ENTER確認。確認檢測器和微流控制單元倉門關閉、背板電纜連接正確,按RUN 執行 注意,改變電壓輸出極性時,還要改變后面板高壓線的插孔位置,設置輸出為正電壓時,后面板高壓線插在“HV+”孔,設置輸出為負電壓時,后面板高壓線插在“HV-”孔,地線始終接在“HV0”孔不變;設置好輸出電壓極性,按ENTER鍵 確定 3.3 模式下,還需輸入電動進樣的電壓和時間。把進樣條件和運行電泳的條件設好后,首先運行一下RUN ,按RESET鍵斷電后按INJECT ,系統執行進樣設置,完成后電壓降至0。(每次改條件后都要先運行一下RUN后才能進樣) 3.4 RESET鍵:進樣、升壓時按下,電壓降至0;分析完成,按此鍵退至上級菜單。 裝柱: 1.裝柱前首先把毛細管檢測窗口和檢測池裝檢測窗口的位置都用分析純的乙醇擦干凈,等乙醇揮發完后,可以裝柱。(注意不要用口吹干)2.把柱子的檢測窗口對準檢測池的小球,對著光看,是透光的說明位置正好3.固定柱子的PEEK螺絲的PEEK管要插到底部固定螺絲,否則毛細管裝好后還會移動。4.然后蓋上蓋子,按對角順序上四個螺絲并固定住。(注意不要一次性擰緊一個螺絲)5.螺絲固定后,把出口端的毛細管插到PEEK管里,把池子安裝到檢測器上,6.打開檢測器,自檢結束后,按FUNC/BACK 滾動至看Sample和reference 值是否正常,如果sample值太小,說明柱子沒裝好。7.卸柱子時,一定要把柱子出口端的毛細管從PEEK管里拔出,是毛細管柱子處于自由狀態后才卸四個螺絲。否則容易把柱子折斷。分析樣品: 1.確認各部分正確連接,開啟電源,啟動數據采集軟件UnimicroTriSep Workstation。設置參數及程序,平衡色譜柱2.設置工作站信號采集時間等,工作站工具欄綠色示意燈狀態,準備采集信號3.當進樣控制面板的LOAD燈亮時,用微量進樣器進樣,此時,樣品被注入到進樣閥的定量環中,定量環的體積是固定的2 ? l(本系統中見入毛細管柱內的樣品量通常是10 ? L或20 ? L),與實際進樣量無關,多余的樣品會流到樣品廢液瓶中。但應注意,由于在進樣孔與進樣閥之間存在一個連接管,其體積約10 ?L,因此,每當進一個新的樣品時,第一次進樣的進樣量要大于40 ?L,以確保樣品置換了進樣管路里所有的溶液到達進樣閥的定量環,以后每次進樣,進樣量只須5?L即可。要將樣品注入色譜柱中時,按進樣控制面板上的按鍵,經過約1 s后,INJECT燈亮,表示樣品池已被連入流路系統,樣品開始進入色譜柱。當INJECT燈亮時系統自動開始采集數據。同時需按下主泵RUN鍵開始梯度程序、高壓電源RUN 啟動高壓電場。4.分析結束,存儲色譜數據,RESET停止高壓。5.清洗色譜柱、儀器管路、進樣針,進樣口;關閉各部分電源;填寫使用記錄。用途:分析生物活性肽中草藥多糖等的成分分析.建立中草藥的指紋圖譜.藥品的質量監控.結合高電壓系統可提高分析效率.并使圖譜更清晰明了.
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