雙水相萃取的原理及應用.ppt

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雙水相萃取的原理及應用Aqueous two-phase extraction2014210918 康文淵組員:NF-κB信號通路 劉文榮 王嘉犀 范倩 何亞玲英英釋義 內容 Content1、雙水相萃取的歷史2.雙水相萃取的基本原理3.雙水相萃取的特點4.雙水相萃取的應用ATPE 的歷史:ATPE 的歷史:Beijerinck (??-) 早在1896年,Beijerinck發現,當明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時,得到一個混濁不透明的溶液,隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉), 這種現象被稱為聚合物的不相溶性,從而產生了雙水相體系(Aqueous two phase system,ATPS)。ATPE 的歷史:ATPE 的歷史: 1956年瑞典lund大學的Albertsson教授及其同事開始對雙水相系統進行比較系統研究。測定了許多雙水相系統的相圖,為雙水相萃取系統的發展奠定了基礎。只局限于實驗室內的測定和理論研究。ATPE 的歷史:ATPE 的歷史: Kula教授研究小組對雙水相的應用、工藝流程、操作參數、工程設備、成本分析等進行了大量研究,在應用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術用于酶的大規模分離純化。ATPE 的歷史:ATPE 的歷史: 雙水相萃取可分離多肽、蛋白質、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器、細胞組織,以及重金屬離子等,近年來,還應用于一些小分子,如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應系統用于酶反應,生物轉化,發酵的產物生產與分離的集成。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 萃?。豪梦镔|在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進行分離的技術。 有機溶劑萃?。阂耘c水互不相溶的有機溶劑作萃取劑從水相中萃取目的產物,廣泛應用于抗生素、有機酸、維生素等發酵產品生產。用于蛋白質、核酸、酶等生物大分子的分離很少成功。 反萃?。菏褂盟芤簭挠袡C溶劑中萃取水溶性的物質。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 反膠團萃?。豪帽砻婊钚詣┰谟袡C相中形成的反膠團(reversed micelles),從而在有機相內形成分散的親水微環境。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 反膠團萃?。菏股锓肿釉谟袡C相(萃取相)內存在于反膠團的親水微環境中,消除了生物分子,特別是蛋白質類生物活性物質難于溶解在有機相中或在有機相中發生不可逆變性的現象。 超臨界萃?。?ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 以上方法對蛋白質的分離純化有不同的缺陷。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 到目前為止,雙水相技術幾乎在所有的生物物質如:氨基酸、多肽、核酸、細胞器、細胞膜、各類細胞、病毒等的分離純化中得到應用, 特別是成功地應用在蛋白質的大規模分離中。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據物質在兩相間的選擇性分配。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理 當萃取體系的性質不同時,物質進入雙水相體系后,由于表面性質、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等) 的存在和環境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。 ATPE 的基本原理: ATPE 的基本原理常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理高聚物/高聚物體系:聚乙二醇(簡稱PEG) / 葡聚糖(簡稱Dextran) 高聚物/無機鹽體系:硫酸鹽體系。常見的高聚物/ 無機鹽體系為: PEG/ 硫酸鹽或磷酸鹽體系。 常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol)Kpi = 磷酸鉀DX = 葡聚糖(dextran)常用的雙水相體系: ATPE 的基本原理PEG/Dx體系一般用于小規模地分離生物大分子、膜、細胞等,PEG/無機鹽體系主要用來大規模地提純酶,這是因為PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高,葡聚糖價格昂貴的緣故。 ATPE 的基本原理各種類型的雙水相體系相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關系 ATPE 的基本原理相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關系 ATPE 的基本原理雙節線(bi-nodal):圖中的曲線。雙節線以下的區域為均相區,以上的區域為兩相區,即ATPS 。 系線(tie line):雙節線上連兩點的直線。K點:K點為臨界點,表示兩相差別消失。相圖:相平衡時物系的組成, 溫度與壓力的關系 ATPE 的基本原理系線反映的信息 杠桿規則:系線上各點均為分成組成相同,而體積不同 的兩相。兩相體積近似服從杠桿規則 性質差異:系線的長度是衡量兩相間相對差別的尺度, 系線越長,兩相間的性質差別越大;反之則越小.影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理聚合物分子量的影響: 對于給定的相系統,如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替,被萃取的大分子物質,如蛋白質、核酸、細胞粒子等,將有利于在低分子量高聚物一側分配。 影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理聚合物分子量的影響: 如以Dextran 500(MW 500 000)代替Dextran 40(MW 40 000),即增大下相高聚物的分子量,被萃取的低分子量物質如細胞色素C分配系數增加并不顯著。然而,被萃取的大分子量物質,如過氧化氫酶的分配系數可增大到原來的6~7倍。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理pH 值的影響:改變兩相的電位差 如體系pH值與蛋白質的等電點相差越大, 則蛋白質在兩相中分配越不均勻。 pH值的變化也會影響磷酸鹽的離解程度,導致組成體系的物質電性發生變化,也會使被分離物質的電荷發生改變,從而影響分配的進行。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理離子環境對蛋白質在兩相體系分配的影響: 在雙水相聚合物系統中,加入電解質時,其陰陽離子在兩相間會有不同的分配。 同時,由于電中性的約束, 存在一穿過相界面的電勢差(Donnan電勢) ,它是影響荷電大分子,如蛋白質和核酸等分配的主要因素。影響雙水相萃取的因素 ATPE 的基本原理例如,DNA萃取時,離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉移到另一相。 ATPE 的基本原理離子液體BmimPF6直接萃取DNA ATPE 的基本原理基于離子液體BmimPF6的雙水相體系直接萃取牛血清蛋白。雙水相的特點 ATPE 的特點對生物物質、天然產物、抗生素等的提取、純化方面的優勢: (1)含水量高(70%~90%),在接近生理環境的體系中進行萃取,避免生物活性物質失活或變性。 (2)可以直接從含有菌體的發酵液和培養液中提取所需的蛋白質(或酶),可直接提取細胞內酶,避免破碎或過濾等步驟。 雙水相的特點 ATPE 的基本原理 (3)分相時間短,自然分相時間一般為5min~15 min。 (4)界面張力小(10-7~ 10-4mN/m),利于兩相之間的質量傳遞。(5)不存在有機溶劑殘留問題,高聚物不易揮發,對人體無害。 雙水相的特點 ATPE 的基本原理(6)大量雜質可與固體物質一同除去。 (7)易于工藝放大和連續操作,與后續提純工序可直接相連接,無需進行特殊處理。 (8)操作條件溫和,在常溫常壓下進行。 (9)親和雙水相萃取技術可以提高分配系數和萃取的選擇性。 雙水相的特點 ATPE 的基本原理雖然該技術在應用方面已經取得了很大的進展,但幾乎都是建立在實驗的基礎上,到目前為止還沒能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統的形成機理以及生物分子在系統中的分配機理。 雙水相的特點 ATPE 的基本原理不足之處:如易乳化、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等, 雙水相萃取的應用 ATPE 的基本原理雙水相系統平衡時間短,含水量高,界面張力低,為生物活性物質提供了溫和的分離環境。它還具備操作簡便、經濟省時、易于放大。據報道,系統可從10ml直接放大到1m3規模(105倍),而各種試驗參數均可按比例放大,產物收率并不降低。 雙水相萃取的應用 ATPE 的基本原理英英釋義1、蛋白質、酶的純化2、多肽的分離純化3、核酸的分離純化4、其它分離純化雙水相萃取的應用 ATPE 的基本原理主要是分離蛋白質 ,酶,病毒,脊髓病毒和線病毒的純化,核酸,DNA的分離,干擾素,細胞組織,抗生素,多糖,色素,抗體等。 雙水相萃取的應用 ATPE 的基本原理1) 蛋白質、酶的純化2) 多肽的分離純化 雙水相萃取的應用 ATPE 的基本原理目前,用此法來提純的酶已達數十種,其分離過程也達到相當規模,I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4體系從Trichoderma koningii發酵液中分離純化β-木糖苷酶,該酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,純化倍數33。 ATPE 的基本原理以蛋白質的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第一步:所選擇的條件應使蛋白質產物分配在富PEG的上相中, 而細胞碎片及雜質蛋白質等進入下相。 ATPE 的基本原理以蛋白質的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:包括三步雙水相分離,第二步:分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質、蛋白質也進入下相,而所需的蛋白質再次進入富含PEG的上相。 ATPE 的基本原理以蛋白質的分離為例說明雙水相分離過程的原則流程:第三步:向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質進入富鹽的下相,以與大量的PEG分開。蛋白質與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術。 ATPE 的應用雙水相萃取的應用 ATPE 的應用雙水相萃取的應用雙水相萃取的應用 ATPE 的應用3) 核酸的分離純化 ATPE 的應用4) 病毒、細胞器、細胞的分離 ATPE 的應用4) 病毒、細胞器、細胞的分離 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取 甘草、銀杏液、黃芩苷等的有效成分分離。 謝濤等利用 PEG 4000/ K2HPO4 組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷,回收率為 96 %。 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取( 1 )將 PEG和 K2HPO4 配成一定濃度的濃溶液; ( 2)在常溫下, 取三七濃縮液置于10ml的離心試管中, 加入一定體積的成相物質濃溶液,振蕩搖勻,在離心機中以一定轉速離心 5min, 使其分相; 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取( 3 )分別讀取上下相體積, 并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用5)中草藥成分的提取 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用6)雙水相萃取分析 黃毒苷的免疫測定雙水相萃取的應用 ATPE 的應用7)稀有金屬/貴金屬分離 克服溶劑萃取法的不足。 在聚乙二醇 2000/硫酸按/偶氮胂(shen四聲) ( Ⅲ)雙水相體系中 ,實現了 Ti ( Ⅳ)與 Zr(鋯gao) ( Ⅳ)的分離 雙水相萃取的應用 ATPE 的應用7)稀有金屬/貴金屬分離 分別在 60 ml 分液漏斗中加入不同 pH 值的緩沖溶液 2 ml , 偶氮胂 Ⅲ 溶液 0. 6 ml , PEG 溶液 5ml和一定量的金 屬離子溶液 , 用 水定容到 10ml , 再加入 2g 固體(NH4) 2SO 4, 振蕩 3 ~5min , 靜置 , 待兩相分層清楚后 , 將下層水相放入 25ml 比色管中 , 測定金屬離子在下層水相中的殘留量 , 從而計算萃取率 。雙水相萃取的應用 ATPE 的應用7)稀有金屬/貴金屬分離 雙水相萃取的發展 ATPE 的發展1)開發廉價雙水相體系 2)將雙水相同其它分離技術相結合,從而提高分離效率,使雙水相萃取技術能夠有更高的生命活力!雙水相萃取的發展 ATPE 的發展兩種雙水相體系的比較雙水相萃取的發展 ATPE 的發展變性淀粉PPT-PEG體系已被用來從發酵液中分離過氧化氫酶,β-半乳糖苷酶等。①蛋白溶解度大。②粘度小。③價格便宜。雙水相萃取的發展 ATPE 的發展(1) 與溫度誘導相分離、磁場作用、超聲波作用、氣溶膠技術等實現集成化,改善了雙水相分配技術中諸如成相聚合物回收困難、相分離時間較長、易乳化等問題,為雙水相分配技術的進一步成熟、完善并走向工業化奠定了基礎。雙水相萃取的發展 ATPE 的發展(2) 與親和沉淀、高效層析等新型生化分離技術實現過程集成,充分融合了雙方的優勢,既提高了分離效率,又簡化了分離流程。雙水相萃取的發展 ATPE 的發展(3)在生物轉化、化學滲透釋放和電泳等中引入雙水相分配,給已有的技術賦予了新的內涵,為新分離過程的誕生提供了新的思路。謝謝!
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