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微生物學實驗教案.doc

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?微 生 物 實 驗 教 案實驗一 顯微鏡油鏡的使用和細菌形態的觀察一、實驗目的以染色玻片為例,熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。二、實驗原理1 顯微鏡油鏡使用的原理1普通光學顯微鏡的基本構造(1)光學部分: 接目鏡、接物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大, 造成物象。(2)機械部分: 鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺轉移器、粗調節器、細調節器等部件。它起著支持、調節、固定等作用。2顯微鏡的放大倍數和分辨率(1)放大倍數=接物鏡放大倍數×接目鏡放大倍數(2)顯微鏡的分辨率:表示顯微鏡辨析物體(兩端)兩點之間距離的能力,可用公式表示為:D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D:物鏡分辨出物體兩點間的最短距離。 λ:可見光的波長(平均0.55μm)n: 物鏡和被檢標本間介質的折射率。a:鏡口角(即入射角)。3油鏡使用的原理油鏡,即油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時,由于空氣與玻片的密度不同,使光線受到曲折,發生散射,降低了視野的照明度。若中間的介質是一層油(其折射率與玻片的相近),則幾乎不發生折射,增加了視野的進光量,從而使物象更加清晰。三、實驗材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。2枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的玻片染色標本。四、實驗方法與步驟(1)用前檢查:零件是否齊全,鏡頭是否清潔。(2)調節光亮度。(3)低倍鏡觀察:先粗調再微調至物象清晰。(4)轉入中倍、高倍觀察,每一不只需調微調旋紐即可看到清晰的物象。(5)油鏡觀察:高倍鏡下找到清晰的物象后,旋轉轉換器,在標本中央滴一滴香柏油,使油鏡鏡頭浸入香柏油中,細調至看清物象為止。(6)繪出所觀察到的細菌形態圖像。(7)、換片:另換新片觀察,必須從(3)步開始操作。(8)、用后復原:觀察完畢,上懸鏡筒,先用擦鏡紙擦去油鏡頭上的香柏油,然后再用擦鏡紙沾取少量二甲苯擦去殘留的油,最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯,后將鏡體全部復原。五、實驗報告油鏡使用的原理 繪制細菌形態六、思考題1油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同?應特別注意些什么?2使用油鏡時,為什么必須用鏡頭油?七、實驗注意事項1不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2鏡面只能用擦鏡紙擦,不能用手指或粗布,以保證光潔度。3觀察標本時,必須依次用低、中、高倍鏡,最后用油鏡。當目視接目鏡時,特別在使用油鏡時,切不可使用粗調節器,以免壓碎玻片或損傷鏡面。4觀察時,兩眼睜開,養成兩眼能夠輪換觀察的習慣,以免眼睛疲勞,并且能夠在左眼觀察時,右眼注視繪圖。5拿顯微鏡時,一定要右手拿鏡臂,左手托鏡座,不可單手拿,更不可傾斜拿。6顯微鏡應存放在陰涼干燥處,以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。八、教學反饋實驗二 細菌的簡單染色一、實驗目的熟練掌握顯微鏡油鏡的使用方法。學習染色的基本技術,二、實驗原理簡單染色的原理大多數微生物細胞質是帶負電荷,簡單染色時采用已知的、帶正電荷的堿性染料。染料適用于熱固定的涂片,染料與菌體細胞質黏附使菌體著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明對比。三、實驗材料 1顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、接種環、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。2、培養12-18h的枯草芽孢桿菌和大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌。3、簡單染色液(美藍染色液、黑色素液或炭素墨水)四、實驗方法與步驟1、活菌制片觀察取一張干凈的載玻片,在其中央滴上一滴干凈的蒸餾水,取培養12-18h的枯草芽孢桿菌一小環,在水滴上反復涂抹至菌體充分分散,蓋上蓋玻片,用吸水紙吸去多余的水分,按照油鏡的使用步驟,觀察草芽孢桿菌形態,邊觀察邊繪圖。2、簡單染色(1) 涂片:取兩塊干凈的載玻片,各滴一小滴生理鹽水于載玻片中央,用無菌操作分別挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌于二載玻片的水滴中(每一種菌制一片),調勻并涂成薄膜。注意滴生理鹽水時不宜過多,涂片必須均勻。(2) 干燥:自然氣干或酒精燈高處微微加熱。(3) 固定:于火焰上通過2—3次。(4) 染色:在整個涂面上滴加齊氏石炭酸復紅,染色1分鐘。(5)水洗:傾去染液,用自來水細流沖洗至流下的水中無染料顏色為止。(6)干燥:空氣中自然干燥或在酒精燈高處微微加熱。(7)鏡檢:在油鏡下觀察細菌形態。五、實驗報告油鏡使用的原理 繪制細菌形態六、思考題1鏡檢標本時,為什么先用低倍鏡觀察,而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察?2根據實驗體會,你認為制備染色標本時,應注意哪些事項?七、教學反饋實驗三 細菌的革蘭氏染色一、實驗目的1掌握革蘭氏染色。2了解革蘭氏染色法的原理及其在細菌分類鑒定中的重要性。二、實驗原理1 革蘭氏染色的原理革蘭氏陽性菌的細胞壁主要有肽聚糖形成的網狀結構組成,在染色過程中,當用95%乙醇處理時,由于脫水而引起網狀結構中的孔徑變小,細胞壁的通透性降低,使結晶紫-碘復合物被保留在細胞壁內而不易脫色,因此呈藍紫色。革蘭氏陰性菌的細胞壁中肽聚糖含量低,脂類物質含量高,當用乙醇處理時,脂類物質溶解,細胞壁的通透性增加,使結晶紫-碘復合物容易被乙醇抽提出來而脫色,然后又被染上了復染劑的顏色,因此呈現紅色。三、實驗材料1大腸桿菌24h的斜面培養物。2葡萄球菌24h的斜面培養物。4革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸復紅)5載玻片、蓋玻片、接種環、鑷子、酒精燈、火柴、玻璃鉛筆、蒸餾水等。6顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙等。四、實驗方法和步驟附表1細菌染色法分類附表2 微生物染色常用染料A酸性染料:如酸性復紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等。B堿性染料:一般有堿性復紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結晶紫、美蘭、甲基紫等,細菌易被堿性染料染色。C中性(復合)染料:如伊紅、美蘭等,Wright染料和Gimsa染料等(常用于細胞核染色)。D單純染色:這類染料物,不溶于水,但溶于脂肪溶劑中,如蘇丹類(Sudan b)的染料2革蘭氏染色(1)涂片。(2)初染:在做好的涂面上滴加草酸銨結晶紫染液,染1分鐘,傾去染液,流水沖洗至無紫色。(3)媒染:先用新配的盧哥氏碘液沖去殘水,而后用其覆蓋涂面1分鐘,后水洗。(4)脫色:除去殘水后,滴加95%酒精進行脫色約30秒,后立即用流水沖洗。(5)復染:滴加番紅染色液,染1分鐘,水洗后用吸水紙吸干。(6)鏡檢:觀察染色結果。五、實驗報告1 革蘭氏染色的基本原理和意義2 革蘭氏染色成敗的關鍵六、思考題1根據實驗體會,你認為制備染色標本時,應注意哪些事項? 2制片為什么要完全干燥后才能用油鏡觀察?3做革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚?其染色成敗的關鍵一步是什么?4當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時,怎樣能確證。省略部分。用兩個重復時,應選取兩個平板的平均數。如果一個平板有較大片狀菌落生長時,則不宜采用,而應以無片狀菌落生長的平板計數作為該稀釋度的菌數。若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,可計算半個平板后乘2以代表整個平板的菌落數。    ②稀釋度的選擇:a. 應選擇平均菌落數在30-300之間的稀釋度,乘以該稀釋倍數報告之(表1例1)。    b.若有兩個稀釋度,其生長的菌落數均在30-300之間,則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應報告其平均數;若比值大于2,則報告其中較小的數字(l例2、例3)。c.若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(l例4)。d.若所有稀釋度的平均菌落數均小于30、則應按稀釋倍數最低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之(1例5)。e. 若所有稀釋度均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數報告之(表1例6)。    f. 若所有稀釋度的平均菌落數均不在30-300之間,則以最接近30或300的平均菌落數乘以該稀釋倍數報告之(表l例7)。    ③細菌總數的報告:    細菌的菌落數在l00以內時,按其實有數報告;大于100時,用二位有效數字,在二位有效數字后面的數字,以四舍五入方法修約。為了縮短數字后面的0的個數,可用10的指數來表示,如表1“報告方式”一欄所示。(3)大腸菌群的測定(多管發酵法): (一)自來水檢查: 1、初(步)發酵實驗 在2個含有50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵瓶中,各加入100ml水樣;在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管中,各加入10ml水樣(見圖)。搖勻后,37℃下培養24小時,24小時未產氣的繼續培養至48小時。 2、平板分離 經24小時培養后,產酸產氣及48小時產酸產氣的發酵管(瓶),分別劃線接種于尹紅美藍瓊脂平板上,再于37℃下培養18-24小時,將符合下列特征的菌落的一小部分,進行涂片,革蘭氏染色,鏡檢。⑴深紫黑色、有金屬光澤。⑵紫黑色、不帶或略帶金屬光澤;⑶淡紫紅色、中心顏色較深。 3、復發酵實驗 經涂片、染色、鏡檢,如為革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌,則挑取該菌落的另一部分,重新接種于普通濃度的乳糖蛋白胨發酵管中,每管可接種來自同一初發酵管的同類型菌落1-3個,37℃下培養24小時,結果若產酸又產氣,即證實有大腸菌群存在。 證實有大腸菌群存在后,再根據初發酵的陽性管(瓶)數查表,即得大腸菌群數(見表一)。表一 接種水樣總量300ml(100ml2份、10ml10份) 100ml水量陽性管數10ml水量陽性管數 0 1 2每升水樣中大腸菌群數每升水樣中大腸菌群數每升水樣中大腸菌群數0230 (二)、池水、河水或湖水等的檢查: 1、將水樣稀釋成10-1與10-2。 2、分別吸取1ml10-2、10-1的稀釋水樣和1ml原水樣,各注入裝有10ml普通濃度的乳糖蛋白胨發酵管中。另取10ml和100ml原水樣,分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白胨發酵管(瓶)中。 3、以下步驟同自來水的平板分離和復發酵實驗。 4、將100、10、1、0.1(10-1)ml水樣的發酵管結果查表見表二:將10、1、0.1(10-1)、0.01(10-2) ml水樣的發酵管結果查表見表三:即得每升水樣中大腸菌群數表二 接種水樣總量111.1ml(100、10、1、0.1ml各1份)接種水樣量(ml)每升水樣中大腸菌群數1001010.1----2380 表三 接種水樣總量11.11ml(10、10、0.1、0.01ml各1份)接種水樣量(ml)每升水樣中大腸菌群數1010.10.01----90---+90--+-90-+--95--++180-+-+190-++-220+---230-+++280+--+920+-+-940+-++1800++--2300++-+9600+++-23800++++23800“+”發酵陽性、“-”發酵陰性表 1 稀釋度的選擇及細菌數報告方式 稀釋度及菌落數兩稀釋度之比菌落總數/(cfu/g或cfu/mL)報告方式(菌落總數)/(cfu/mL或cfu/g)10-110-210-31多不可計16420-1640016000或1.6×1042多不可計295461.63775038000或3.8×1043多不可計271602.22710027000或2.7×1044多不可計多不可計313-313000310000或3.1×105527115-270270或6000-<10<107多不可計30512-3050031000或3.1×1041)生活飲用水或食品生產用水的檢驗:      五、實驗報告: 1、結果: (1)自來水 100ml水樣的陽性管數是多少? 10ml水樣的陽性管數是多少? 查表一得每升水樣中大腸菌群是多少? (2)池水、河水或湖水 陽性結果記“+”;陰性結果記“-”。 查表二得每升水樣中大腸菌群是多少? 查表三得每升水樣中大腸菌群是多少? 2、思考題: p188(1-3)六、教學反饋
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