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實驗八_酵母RNA的提取與成分鑒定(濃鹽法).ppt

'實驗八_酵母RNA的提取與成分鑒定(濃鹽法).ppt'
實驗八 酵母RNA的提取及 成分鑒定(濃鹽法)實驗目的 掌握濃鹽法提純RNA的基本原理和方法 了解RNA成分鑒定的原理及其方法實驗原理 核酸的分類與分布 DNA:主要存在于細胞核的染色體中, 線粒體、葉綠體、質粒有少量 RNA:存在于細胞質中 樣本的選擇: 酵母RNA(RNA占干重的3%-10%) 制備方法: 稀堿法、濃鹽法破碎細胞提取純化I.材料準備II.破碎細胞或包膜-內容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸,并去除雜質 V.核酸溶解在適量緩沖液或水中 制備過程: RNA以可溶性鈉鹽的形式游離析出離心去除菌體,收集上清液,調至RNA的等電點(pH2~2.5)使RNA沉淀析出,離心收集沉淀乙醚洗滌沉淀、去除雜質、提純RNA濃鹽加熱使酵母細胞壁破裂,蛋白質變性沉淀 RNA提取方法(濃鹽法) RNA成分鑒定RNA在強酸性條件下沸水浴加熱可以水解:1. 磷酸鑒定通過鑒定RNA的三種水解產物來鑒定RNA:鉬酸銨磷鉬酸+FeSO4鉬藍(藍色)2. 堿基(嘌呤)鑒定3. 核糖鑒定5-甲基間苯二酚(藍綠色)糠醛儀器試劑 儀器精密pH試紙(pH0.5~5.0)、廣泛pH試紙(pH1~14)、冰塊、錐形瓶、離心機、天平、電爐 干酵母、10%NaCl、6M HCl、冰塊、5%氨水、(NH4)2MoO4 試劑實驗操作 酵母RNA提?。?人一組) 1. 酵母破壁:10%NaCl(40mL)100mL錐形瓶煮沸加入干酵母(一勺)沸水浴40min取出冷卻玻棒攪勻取出錐形瓶自來水冷卻后轉入50mL離心管3500rpm離心 5min取上清2.離心分離RNA兩兩平衡后對稱放入離心機中3.沉淀提純RNA 將上清液轉入小燒杯中(不可帶入沉淀)冰浴中冷卻用6M HCL調 pH值至 2.0~2.5(RNA等電點)冰浴中靜置5-10min(可見燒杯底部有大量沉淀)輕輕搖勻后轉入離心管,兩兩平衡后對稱放入離心機3500rpm離心5min,并收集沉淀精密試紙如何調pH值?2.0 RNA成分鑒定溶解RNA2. 水解RNA(此處開始2人一組)加22d 1.5M H2SO4沸水浴10min取5ml RNA至大試管 溶液澄清加1d蒸餾水 攪成糊狀 加10ml蒸餾水攪勻 加5%氨水至pH6-7,繼續滴加至沉淀完全溶解廣泛試紙核糖鑒定:20d水解液+20d Fe3+·HCL+2d 5%的5-甲基間苯二酚3. RNA成分鑒定嘌呤鑒定:20d水解液+20d 0.1mol AgNO3磷酸鑒定:20d水解液+20d鉬酸銨 +FeSO4結晶粉加濃氨水至沉淀消失+10d 濃氨水沸水浴15min搖勻沸水浴2min沸水浴2-3min???(綠豆大?。╇x心機的使用方法1.選擇合適的離心管2.使用天平對所離心樣本(包括離心套筒)稱量配平3.打開離心機電源,設定離心速度和離心時間4.按“停止”鍵打開離心機蓋子,將樣本按中心對稱放置5.蓋緊蓋子,按“離心”鍵啟動離心6.離心結束后,待儀器完全停止轉動后方可打開蓋子取出離心管實驗結果 1 2 31號:磷酸鑒定(藍色)2號:堿基鑒定(紅棕色)3號:核糖鑒定(藍綠色)思考題 在酵母破壁時為什么只能水煮沸了以后再放入裝有酵母和10% NaCl的三角瓶? 本實驗中兩次調pH值的目的分別是什么?實 驗 九 酶法測血糖預 習知識回顧Knowledge Review祝您成功!
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